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PI 凋亡检测试剂盒是细胞的基本特征之一,使用详情!

发布时间:2020/1/17点击次数:72

PI 凋亡检测试剂盒是细胞的基本特征之一,使用详情!


细胞凋亡是细胞的基本特征之一,在机体的胚胎发育、组织修复、内环境的稳定等方面都起到十分重要的作用。Annexin V 是一种分子量为 35.8 KD 的 Ca2+依赖性磷脂结合蛋白,能与细胞凋亡过程中翻转到膜外的磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine, PS)高亲和力特异结合。FITC-Annexin V 结合到凋亡细胞后,在蓝色光的激发下,发出绿色荧光,区分出凋亡细胞与正常细胞。


碘化丙啶(Propidium iodide,PI)是一种核酸染料,它不能穿透完整细胞膜,但对凋亡晚期细胞和死细胞的破损细胞膜能够穿透,并使细胞核红染。将 FITC-Annexin V 与 PI 匹配使用,可以将凋亡早期的细胞和晚期的细胞区分开来。







使用方法:
 
1、 用 27ml 的去离子水稀释 3ml Binding Buffer(10×)至 30ml,每次用 3ml。
2、 收集细胞(1×106 个/次),然后用冷的 PBS 洗涤。(对于贴壁细胞,先用胰酶消化,再用 PBS 洗涤)。
3、 用 1ml 1×的 Binding Buffer 悬浮细胞,300×g 离心 10min,弃上清。
4、 用 1ml 1×的 Binding Buffer 重悬细胞,使细胞的密度达到 1×106 个/ml。
5、 每管加入 100μL 细胞(1×105 个)。
6、 再向管中加入 5μL Annexin V-FITC。
7、 室温,避光,轻轻地混匀,10min。
8、 加入 5μL PI,室温,避光,孵育 5min。
9、 加入 PBS 至 500μL,轻轻混匀。
10、在 1 小时内用流式细胞仪检测。


注意事项:
 
1、旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心,将盖内壁上的液体甩至管底,避免开盖时液体洒落。
2、Annexin V-FITC 和 Propidium iodide 是光敏物质,在保存与操作时请注意避光。
3、Propidium iodide(PI)能通过皮肤吸收,对眼睛有刺激作用。
4、在细胞洗涤的最后一步,请尽量将上清弃净,以免 PBS 残留影响实验结果。
5、PI 染色时间过长有可能造成检测的凋亡率偏高,建议首先进行 Annexin V-FITC 染色,上机前 5分钟再加入 PI 染色。
6、整个操作过程动作要尽量轻柔,勿用力吹打细胞,尽量在 4℃下操作。
7、反应完毕后请尽快检测,因为细胞凋亡是一个动态的过程,反应 1 小时后荧光强度就开始衰变。
8、成功的检测凋亡受以下几种因素的影响,如细胞类型、细胞膜上 PS 的密度、发生凋亡时 PS 翻转的比例、诱导细胞凋亡的方法、所用试剂、诱导凋亡的时间等,把这些影响因素进行优化对实验成功是非常必要的。





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